Aplicación de tecnologías de secuenciación masiva para el análisis transcripcional de células CHO-K1 y utilización de nuevas regiones promotoras endógenas para la expresión de proteínas recombinantes en cultivos celulares
Fil: Tossolini, Ileana del Rosario. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina.
Guardado en:
| Autor Principal: | |
|---|---|
| Otros Autores: | |
| Formato: | Tesis |
| Lenguaje: | Spanish |
| Publicado: |
2019
|
| Materias: | |
| Acceso en línea: | http://hdl.handle.net/11185/3287 |
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oai:bibliotecavirtual.unl.edu.ar-handle:11185-3287 |
|---|---|
| recordtype |
dspace |
| institution |
Universidad Nacional del Litoral |
| collection |
Biblioteca de tesis |
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Spanish |
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CHO-K1 Cell cycle RNA-seq Endogenous promoters Recombinant proteins Expression vectors CHO-K1 Ciclo celular RNA-seq Promotores endógenos Proteínas recombinantes Vectores de expresión |
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CHO-K1 Cell cycle RNA-seq Endogenous promoters Recombinant proteins Expression vectors CHO-K1 Ciclo celular RNA-seq Promotores endógenos Proteínas recombinantes Vectores de expresión Tossolini, Ileana del Rosario Aplicación de tecnologías de secuenciación masiva para el análisis transcripcional de células CHO-K1 y utilización de nuevas regiones promotoras endógenas para la expresión de proteínas recombinantes en cultivos celulares |
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Fil: Tossolini, Ileana del Rosario. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. |
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Prieto, Claudio César |
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Prieto, Claudio César Tossolini, Ileana del Rosario |
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Thesis |
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Tossolini, Ileana del Rosario |
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Tossolini, Ileana del Rosario |
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Aplicación de tecnologías de secuenciación masiva para el análisis transcripcional de células CHO-K1 y utilización de nuevas regiones promotoras endógenas para la expresión de proteínas recombinantes en cultivos celulares |
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1728291208235581440 |
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oai:bibliotecavirtual.unl.edu.ar-handle:11185-32872022-03-17T17:47:53Z Aplicación de tecnologías de secuenciación masiva para el análisis transcripcional de células CHO-K1 y utilización de nuevas regiones promotoras endógenas para la expresión de proteínas recombinantes en cultivos celulares Application of next generation sequencing technologies for transcriptional analysis of CHO-K1 cells and use of new endogenous promoter regions for recombinant protein expression in mammalian cell cultures Tossolini, Ileana del Rosario Prieto, Claudio César Amadio, Ariel Fernando Claus, Juan Daniel Gòdia, Casablancas Francesc Kratje, Ricardo Bertoldo CHO-K1 Cell cycle RNA-seq Endogenous promoters Recombinant proteins Expression vectors CHO-K1 Ciclo celular RNA-seq Promotores endógenos Proteínas recombinantes Vectores de expresión Fil: Tossolini, Ileana del Rosario. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. La producción de proteínas recombinantes terapéuticas es una de las áreas de mayor crecimiento dentro de la industria farmacéutica. Las células de ovario de hámster chino (CHO) constituyen el sistema huésped de elección. El objetivo general del presente trabajo de Tesis fue la aplicación de las nuevas tecnologías de secuenciación masiva a la línea celular CHO-K1, con el fin de desarrollar estrategias de ingeniería genética mediante el análisis bioinformático de los datos generados. Se caracterizó el ciclo celular de células CHO-K1 cultivadas en un biorreactor, evidenciando un enriquecimiento del cultivo en células sincronizadas en fase G0/G1 en las etapas tanto del crecimiento exponencial tardío como hacia los últimos días de la fase estacionaria. Mediante el análisis del transcriptoma de células CHO K1 cultivadas en alta densidad se observó que los mayores cambios regulatorios ocurrieron durante la fase estacionaria. Por otro lado, se eligieron 13 genes con elevada expresión en ambas fases de cultivo en biorreactor; y con sus regiones promotoras se construyeron nuevos vectores de expresión para la producción de proteínas recombinantes. Esto constituye una alternativa al empleo de promotores virales, aprovechando la maquinaria transcripcional regulatoria endógena disponible en las condiciones de un cultivo en alta densidad celular con un medio de cultivo definido libre de suero fetal bovino. El resultado más promisorio se obtuvo con el promotor endógeno (Gen X), el cual mostró un comportamiento equivalente al promotor CMV en células HEK y CHO-K1. The production of therapeutic recombinant proteins is one of the fastest growing areas within the pharmaceutical industry. Chinese hamster ovary (CHO) cells are the main platform commonly used for the industrial production of therapeutic proteins. The main goal of this work was to apply next-generation sequencing technologies to CHO-K1 host cell line, in order to develop genetic engineering strategies from the bioinformatic data analysis. We analyzed cell cycle behavior during a typical industrial bioprocess of suspension-adapted CHO-K1 cells and we found a cell culture state characterized by G0/G1 phase synchronization, mainly during the late exponential growth phase and towards the last days of the stationary phase. We sequenced the transcriptome of CHO-K1 cells cultured in high density and we saw that most important regulatory changes happened throughout the stationary phase. In addition, we selected 13 genes with the highest levels of expression, during both culture stages. By using the promoter sequences of those genes we created new expression vectors for the production of recombinant proteins. This constitutes a promising alternative to the use of viral promoters and leverages the endogenous transcriptional regulatory machinery available during suspension cell cultures using a defined and serum free culture medium. The most promising result was obtained with the endogenous promoter (Gen X), which showed a similar transcriptional activity to CMV promoter, in HEK and CHO-K1 cells. Universidad Nacional del Litoral Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas 2019-07-29T13:40:20Z info:eu-repo/date/embargoEnd/2021-07-25 2019-03-15 25/07/2021 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/acceptedVersion SNRD http://hdl.handle.net/11185/3287 spa info:eu-repo/semantics/embargoedAccess http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/deed.es application/pdf |
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