Optimización de un enzimoinmunoensayo para la evaluación farmacocinética de variantes hiperglicosiladas de eritropoyetina humana (hEPO). - Wandel Petersen, Valentina
La tesina se desarrolló con el fin de mejorar la sensibilidad y el límite de cuantificación de un ELISA sándwich, disponible en el laboratorio, destinado a cuantificar variantes hiperglicosiladas de hEPO, generadas por el grupo de trabajo, como candidatos neuroterapéuticos carentes de actividad eritropoyética. Dicho ELISA fue utilizado para calcular los parámetros farmacocinéticos (PK) de tales proteínas, propiedades que aún no habían sido determinadas dado que, el bloqueo de la acción eritropoyética impedía emplear ensayos de actividad biológica in vitro. La optimización del ELISA sándwich permitió disminuir 10 veces su límite de cuantificación y detección. A partir del mismo se evaluaron los PK de las variantes, las que exhibieron un mayor tiempo de vida media en sangre y presentaron un clearence plasmático entre 1,8 y 2,3 veces menor, en comparación con hEPO. Por otro lado, el anticuerpo monoclonal anti-hEPO (mAb 2B2) es empleado como inmunorreactante en el ELISA sándwich y como ligando en cromatografías de inmunoafinidad para purificar las variantes de hEPO. Con el propósito de disponer del mismo en grandes cantidades, se optimizó su proceso de producción mediante la adaptación de su hibridoma productor a medio de cultivo libre de suero empleando la metodología de diseño de experimentos. Así, se reemplazó la producción in vivo del anticuerpo -que requería del sacrificio de animales de experimentación- por un proceso económico, reproducible, escalable, libre del empleo de animales y de sus derivados; que permitió conservar la afinidad aparente del mAb y mantener los parámetros de crecimiento y producción del hibridoma.